بررسی جهش های ژن CFTR در مردان نابارور مبتلا به انواع مختلف آزوسپرمی انسدادی

دسته بندي : علوم پایه » زیست شناسی
چکیده فارسی:
سیستیک فیبروزیس (CF) یکی از شایع ترین بیماریهای اتوزومال مغلوب در سفیدپوستان ،با  بروز 1 در 2500 است ودر اثر نقص در  ژن CFTR  ایجاد می شود که این ژن، کد کننده پروتئینی است که به عنوان یک کانال کلرید در غشائ سلول های اپیتلیال، لوله های تنفسی، لوزالمعده، روده، غدد عرق و مجاری واز دفران واقع شده است. نقص در ژن CFTR باعث ایجاد غلظت غیر طبیعی کلرید در امتداد غشا سلول های اپیتلیال شده که منجر به بیماری ریوی پیشرونده،اختلال عملکرد پانکراس،افزایش کلریدعرق و ناباروری مردان می شود.در مطالعه حاضر فرکانس و ماهیت جهش ها و برخی از پلی مورفیسم ها ی ژن CFTR در مردان نابارور مبتلا به آزواسپرمی انسدادی ارزیابی شد.
در مجموع از 76 بیمار و 50 مرد بارور ،یک پانل از 5 جهش شایع در CFTR با استفاده از تکنیک PCR - ARMS غربالگری شد همچنین اگزونهای داغ از نظر جهش( 7،10،11،20،21،4) در ژن CFTR با استفاده از روش PCR - SSCP و در پی آن با توالی یابی غربالگری شدند. 18 بیماربا آزواسپرمی و CBAVD ، 53 بیمار مبتلا به آزواسپرمی بدون CAVD (Non-CAVD) و 5 بیمار مبتلا به آزواسپرمی و CUAVD بیماران مورد مطالعه مارا تشکیل می دادند. طول ناحیه پلی T (آللهای 5T،7T و 9T) واقع در splice-acceptor site اینترون 8/اگزون9 و پلی مورفیسم M470V واقع در اگزون 10 با استفاده از روش PCR-RFLP مشخص شد.
در 7 نفراز 18 بیمار مبتلا به CBAVD ، جهش CFTR یافت شد ، سه نفراز بیماران هرکدام دارای یک جهش ΔF508بودند. آلل5T  در سه نفر از این بیماران یافت شد. در یک بیمار ، آلل 5T با جهشی غیر ازΔF508 همراه بود. در بیماران با CUAVD فقط یک جهش CFTR مشاهده شد. جهش های شایع CFTR در 9 نفر از 53بیمارمبتلا به Non-CAVD ، یافت شد و پنج نفر ازاین بیماران دارای یک جهش ΔF508بودند. آلل5T  در پنج مورد از این بیماران یافت شد. در دو بیمار ، آللT5 با ΔF508 همراه نبود و در هشت بیمار حامل آلل 5T هیچیک از جهش های شایع یافت نشدند . در بیماران  مبتلا به  CBAVD ، Non-CAVD و CUAVD فراوانی آلل5Tبه ترتیب22 ٪ ،14 ٪ (معنی دار نسبت به گروه کنترل)و10 ٪ (غیر معنی دار نسبت به گروه کنترل) بدست آمد.
جهش آلل5Tبا طیف وسیعی از تظاهرات بالینی و فرکانس بالا در بیماران CBAVD مشاهده شد.
ژنوتیپ 5T/M470 به ترتیب در 3 ، 5 و 1 نفرو ژنوتیپ 5T/V470 . به ترتیب در 0،1 و  0 نفرو 5T همراه با فرم هتروزیگوت M470V به ترتیب در 5،8و0 نفراز بیماران CBAVD ، غیر CAVD و CUAVDیافت شد.
مشاهدات ما نشان داد که ژن CFTR در روند اسپرماتوژنز و یا در آسیب شناسی دستگاه تناسلی نقش دارد.
در بیماران بر خلاف گروه کنترل فرکانس آلل M470بالاتر از آللV470  بود واین نشان می دهد که آلل M470 با نقص پروتئین CFTRمرتبط است.
اگر مرد مبتلا به CBAVD ، Non-CAVD و CUAVD باشد حتی با وجود سابقه خانوادگی منفی. از نظر CF غربالگری جهش CFTR قبل از درمان ناباروری ضروری خواهد بود
کلمات کلیدی:جهش CFTR ، CBAVD ، آزواسپرمی انسدادی ، تکنیک PCR-ARMS-


فهرست مطالب:
چکیده فارسی        
فصل اول       
1-1 . مقدمه  
1- 2.  ناباروری        
1-2-1 . ناباروری در مردان    
1-2-1-1 . عوامل مؤثر در ناباروري مردان    
1-2-1-1-1. اختلالات ژنتيكي
1-2-1-1-1-1.كروموزوم Y     
1-2-1-1-1-1-1. بازوي كوتاه كروموزوم Y  (YP)      
1-2-1-1-1-1-2. بازوي بلند كروموزوم Y (Yq)        
1-2-1-1-2. انواع ناهنجاري‌هاي اسپرمي در مردان نابارور 
1-2-1-1-2-1.انواع آزوسپرمی        
1-3 . ژن CFTR        
1-3-1 . ساختار پروتئین CFTR       
1-3-2 . عملکرد پروتئین CFTR       
1-3-3 . ارتباط جهش ژن CFTR وبیماری     
1-3-4 . ساختار ژن CFTR    
1-3-5.  ساختار mRNAاي ژن CFTR
1-4 . سیستیک فیبروزیس(فیبروز کیستیک)
1-5.  تشخیص پیش از تولد 
1-6.ضرورت انجام تحقيق     
1-7.اهداف تحقيق    
1-8.سؤالات و فرضیه ها      
فصل دوم      
2-1.تاریخچه ومروری بر مطالعات گذشته    
2-2. تاثير پلی مورفیسم هاي ژن CFTR     
2-3.ارتباط جهش در ژن CFTRوآزواسپرمی 
فصل سوم     
3-1.نمونه گيري       
3-1-1.نمونه هاي خوني      
3-2.استخراج DNAاز نمونه هاي خون        
3-3.تعيين غلظت DNA       
3-3-1. مراحل انجام روش اسپکتروفتومتري
3-3-2. بررسي کيفي DNA استخراج شده به روش الکتروفرز روي ژل آگارز       
3-4. واکنش های زنجیره ای پلی مرازی(PCR)      
3-4-1. مواد اوليه واكنش PCR        
3-4-2. سيكلهايPCR         
3-4-3.روش انجام PCR        
3-5.مواد و محلولهای مورد نیاز برای الكترو فورز ژل آگارز   
3-6.تهيه ژل آگارز5/1%       
3-7. الکتروفرز محصولات PCR بر روي ژل پلي اکريل آميد  
 3-7-1.مواد و محلول های مورد نیاز برای تهیه ژل پلی اکریل آمید
3-7-2. تهيه ژل پلي اكريل
3-7-3.PCR-RFLP     
3-7-4.تهيه ژل SSCP 
3-8. رنگ آميزي ژل پلي آکريل آميد به روش نيترات نقره   
3-8-1. مواد و محلول هاي مورد نياز براي رنگ آميزي نیترات نقره
3-8-2.روش انجام رنگ آميزي نيترات نقره   
3-9.انجام SSCP       
3-10.طراحی پرایمر  
3-11.نحوه آماده سازي پرایمرها     
3-12 PCR-RFLP.  
3-12-1.انجام PCR-RFLP   
3-13. ARMS-PCR..        
3-14.توالی یابیDNA(DNA Sequencing)  
3-15.مراحل خواندن توالي   
3-16.آنالیز آماری     
فصل چهارم   
کلیات 
4-1.بررسی و نگهداری نمونه های حاصل از استخراج DNAژنومی
4-2. نتایج بررسی جهش های شایع ΔF508، G542X، N1303K و W1282X      
4-3. نتایج بررسی جهش شایع W1282X با استفاده از روشSingle ARMS PCR 
4-4. نتایج بررسی جهش R117H   
4-5. نتایج بررسی اگزون10 ژن  CFTRبا استفاده ازتکنیک SSCP – PCR  
4-6. نتایج بررسی اگزون21 با استفاده ازتکنیک PCR-SSCP       
4-7. نتایج بررسی پلی مورفیسم پلیT ژن CFTRبا استفاده ازتکنیک PCR-RFLP.، آنزیم Hpa1 و پرایمرهای CFT5،CF9RRو CFT7،CF9RR
4-8.نتایج بررسی پلی مورفیسم M470V ژن CFTRبا استفاده ازتکنیک PCR-RFLP. و آنزیم Hph1 و پرایمرهای اگزون10       
فصل پنجم    
5-1.بحث وتفسير     
5-2.نتیجه گیری نهائی       
5-3.پیشنهادها        
6. منابع         
چکیده انگلیسی   
فهرست اشکال:
 شكل 1-1. پروتئين CFTR   
شكل 1-2.فرد مبتلابه CFو شجره نامه مربوطه     
شكل2-1.مراحل لقاح خارج رحمي از نوع ميكرو اينجكشن (ICSI)
شکل 3-1. توالي ژن CFTR را نشان مي دهد       
شکل 3-2. مرحله اول خواندن توالي         
شکل 3-3. مرحله دوم از خواندن توالي      
شکل 3-4. مرحله سوم خواندن توالي       
شکل3-5. .مرحله چهارم خواندن توالي     
شکل 3-6. .مرحله پنجم خواندن توالي      
شکل 3-7. .مرحله پاياني خواندن توالي    
شکل 1-4. .نتایج حاصل از استخراج DNA  
شکل 4-2. تعیین جهش های شایع ΔF508، G542X، N1303K    
شکل 4-3. تعیین جهش W1282X با استفاده از روش ARMS-PCR         
شکل 4-4. شناسایی جهش R117H با استفاده از روش PCR-RFLP .    
شکل 4-5-1. نمونه ای از ژل SSCP در مورد اگزون 10 ژن CFTR   
شکل4-5-2.نتیجه توالی یابی جهش حذف(∆F508)در اگزون 10 ژن CFTR        
شکل 4-6-1. نمونه ای از ژل SSCP در مورد اگزون 21 ژن CFTR   
شکل 4-6-2. تغییر نوکلئوتیدی)  3933T>G (S1311R در اگزون 4 ژن CFTR       
شکل 4-7. شناسایی پلی مورفیسم پلیT         
شکل 4-8. شناسایی پلی مورفیسم   M470V     
شکل5-1. پروتئين CFTR     
 شكل 5-2.تاثير آللهاي ويژه روي مقدار پروتئين CFTRداراي عملكرد           
فهرست جدولها:
جدول 2-1. انواع جهش های رایج ژن CFTR و توزیع جهانی آنها   
جدول3-1.پارامترهای  مایع منی و خون بیمارانCAVD Non         
جدول3-2.پارامترهای  مایع منی و خون بیماران  CBAVD  
جدول3-3.پارامترهای  مایع منی و خون بیماران  CUAVD  
جدول.3-4.برنامه PCR براي تکثیر اگزون های7،10،11،20،21ژنCFTR    
جدول.3-5.برنامه PCR براي تکثیر اگزون 4ژن CFTR
جدول.3-6.شرایطPCR براي تکثیر اگزون های7،10،11،20،21،4 ژنCFTR 
جدول3-7.توالی پرایمرهای اگزونهای Hot spot     
جدول3-8. برنامه PCR جهت PCR-RFLP  
جدول.3-9.شرایطPCR براي PCR-RFLP    
جدول3-10. توالی پرایمر های اگزون 9/اینترون8 جهت تشخیص  پلی مورفیسم  پلیT 
جدول3-11.توالی پرایمر های اگزون 4 جهت تشخیص  جهش R117H    
جدول3-12. توالی پرایمر های مخصوص ARMS PCR        
جدول3-13.برنامه Multiplex براي تشخيص جهش هاي F508,G542X,N1303K
جدول3-14. برنامه Single ARMS PCR براي تشخيص جهش     
جدول3-15. برنامه Single ARMS PCR براي تشخيص جهش       
جدول.3-16.شرایطPCR براي ARMS-PCR   
جدول 4-1. نحوه شناسایی جهش R117H با استفاده از روش PCR-RFLP        
جدول4-2.نتايج تكنيك ARMS PCR بيماران Non-CBAVD Obstructive Azoospermia مورد مطالعه        
جدول4-3. فركانسهاي آللي و ژنوتيپي بيماران Non-CBAVD Obstructive Azoospermia مورد مطالعه  
جدول4-4.نتايج تكنيك ARMS PCR براي بيماران CBAVD Obstructive Azoospermia     
جدول4-5.نتايج تكنيك ARMS PCR براي بيماران CUAVD Obstructive Azoospermia     
جدول4-6. فركانسهاي آللي و ژنوتيپي در بيماران CBAVD Obstructive Azoospermia   
جدول4-7. فركانسهاي آللي و ژنوتيپي در بيماران CUAVD Obstructive Azoospermia  
جدول4-8.نتايج تكنيك PCR-RFLP براي بيماران Non-CBAVD Obstructive Azoospermia         
جدول4-9.نتايج تكنيك PCR-RFLP براي بيماران CBAVD Obstructive Azoospermia      
جدول4-10.نتايج تكنيك PCR-RFLP براي بيماران CUAVD Obstructive Azoospermia         
جدول4-11.فرکانس ژنوتیپهای پلیT در بیماران CUAVDبا تکنیک  PCR-RFLP    
جدول4-12.فرکانس آللهای پلی T در بیماران CUAVDبا تکنیک  PCR-RFLP       
جدول4-13.فرکانس ژنوتیپهای پلی مورفیسم  M470V در بیمارانCUAVD  با تکنیک  PCR-RFLP
جدول4-14.فرکانس آللهای پلی مورفیسمM470Vدربیماران CUAVD با تکنیک PCR-RFLP  
جدول4-15.نتايج تكنيك PCR-RFLP پلی مورفیسمهای پلی Tو M470Vدرافراد شاهد    
جدول4-16.فرکانس ژنوتیپهای پلیT در بیماران CUAVDبا تکنیک  PCR-RFLP    
جدول4-17.فرکانس آللهای پلیT در بیماران CUAVDبا تکنیک  PCR-RFLP        
جدول4-18.فرکانس ژنوتیپهای پلی مورفیسمM470Vدربیماران CBAVD با تکنیک  PCR-RFLP
جدول4-19.فرکانس آللهای پلی مورفیسمM470Vدربیماران CBAVD با تکنیک PCR-RFLP 
جدول4-20.فرکانس ژنوتیپهای پلیT در بیمارانCAVD Non-با تکنیک  PCR-RFLP
جدول4-21.فرکانس آللهای پلیT در بیمارانCAVD Non-با تکنیک  PCR-RFLP   
جدول4-22.فرکانس ژنوتیپهای پلی مورفیسمM470Vدر بیماران Non-CAVD با تکنیک  .PCR-RFLP      
جدول4-23.فرکانس آللهای  پلی مورفیسمM470V در بیماران  Non-CAVD با تکنیک  PCR-RFLP
جدول4-24.جهش ها و پلی مورفیسم های شناخته شده در 152ژنCFTRدر بیماران مورد مطالعه